Ktl-icon-tai-lieu

Tinh thể hóa lysozyme

Được đăng lên bởi Đậu Đỏ
Số trang: 3 trang   |   Lượt xem: 603 lần   |   Lượt tải: 0 lần
リリリリリリリリリ
1リ  Introduction and Purpose  
The   successful   crystallization   of   any   protein   requires   the   screening   of   a   large 
number   of   conditions,   covering   concentration   of   precipitant,   salt,   protein, 
variations in pH, etc.
In addition, lysozyme has been well characterized with respect to crystallization 
properties. Therefore, this experiment is to provide “hands on” experience on the 
crystallization techniques.
2リ  Method and Materials 
2.1. Method
In this experiment, sitting drop method is used. Sitting drop method is one of most 
popular protein crystallization methods that rely on vapor diffusion, in which a 
drop containing lysozyme/precipitant solution is allowed to equilibrate in a closed 
system containing a reservoir of precipitant. 
2.2. Materials
i) 1M Acetate buffer pH4, containing:
1M Sodium Acetate Trihydrate (20ml) + 1M Acetate (stock Acetate 1ml + MilliQ 
water 16.5ml)
ii) 10% (w/v) NaCl
NaCl 5g + MilliQ water 50ml
iii) 1%, 5%, 10%, 12% (w/v) Lyzozyme 
(100ul for each sample)

(1) Calculate the volume of each component of the reservoir solution required to 
give the correct concentration in the well. 
The desired final volume of precipitant solution for each is 2ml (as shown in 
table below)
10% NaCl (μl)

MilliQ (μl)

1M Acetate Buffer (μl)

0.1M Acetate buffer, 5% NaCl

1000

800

200

0.1M Acetate buffer, 6% NaCl

1200

600

200

0.1M Acetate buffer, 7% NaCl

1400

400

200

0.1M Acetate buffer, 8% NaCl

1600

200

200

0.1M Acetate buffer, 9% NaCl

1800

0

200

(2) For each well of Limbro plate, pipette 500 μl of each precipitant solution onto 
the wells (A1 to A5).
(3) Pipette 3μl of 1% lysozyme onto the center of each well (drop). 
(4) Use fresh tips, add 3μl of the precipitant solution from the well to the 1 st drop. 
Gently   pipette   up   and   down   to   homogenize   the   mixture.   Be   careful   not   to 
create bubbles while pipetting.
(5) Repeat steps 2­4 for wells B to D.
(6) For wells A6 to D6, pipette 500μl MilliQ water onto each to avoid evaporation
(7) Cover the tray with the limbro plate lid. Then incubate at 25C overnight.
3リ  Result    
 
 
Under the microscope:
0.1M   Acetate  0.1M   Acetate  0.1M   Acetate  0.1M   Acetate  0.1M   Acetate 
buffer, 5% NaCl

buffer, 6% NaCl

buffer, 7% NaCl

buffer, 8% NaCl

buffer, 9% NaCl

1% Lysozyme

Precipitation

Precipitation

Precipitation

Precipitation

Precipitation

5% Lysozyme

Precipitation

Precipitation

+  

++++  

Crystals   ...
リリリリリリリリ
1
Introduction and Purpose
The successful crystallization of any protein requires the screening of a large
number of conditions, covering concentration of precipitant, salt, protein,
variations in pH, etc.
In addition, lysozyme has been well characterized with respect to crystallization
properties. Therefore, this experiment is to provide “hands on” experience on the
crystallization techniques.
2
Method and Materials
2.1. Method
In this experiment, sitting drop method is used. Sitting drop method is one of most
popular protein crystallization methods that rely on vapor diffusion, in which a
drop containing lysozyme/precipitant solution is allowed to equilibrate in a closed
system containing a reservoir of precipitant.
2.2. Materials
i)
1M Acetate buffer pH4, containing:
1M Sodium Acetate Trihydrate (20ml) + 1M Acetate (stock Acetate 1ml + MilliQ
water 16.5ml)
ii)
10% (w/v) NaCl
NaCl 5g + MilliQ water 50ml
iii)
1%, 5%, 10%, 12% (w/v) Lyzozyme
(100ul for each sample)
Tinh thể hóa lysozyme - Trang 2
Tinh thể hóa lysozyme - Người đăng: Đậu Đỏ
5 Tài liệu rất hay! Được đăng lên bởi - 1 giờ trước Đúng là cái mình đang tìm. Rất hay và bổ ích. Cảm ơn bạn!
3 Vietnamese
Tinh thể hóa lysozyme 9 10 215